聊聊：单细胞凝胶电泳验

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细胞DNA链断裂时，DNA的超螺旋结构受到破坏，在中性条件时，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱处理和碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来，由于这些DNA的分子量很小，所以在电泳过程中会离开核DNA向阳极移动，形成彗星状的拖尾图像，而未损伤的DNA部分停留在原位，染色后成圆形荧光团。

用途
评价单个细胞的DNA损伤（各种因素的生物反应、肿瘤的研究治疗预测）。

材料与仪器
步骤
1、单细胞悬液制备用胰酶将细胞消化至离心管道中并进行细胞计数，用PBS调节细胞密度至105~106个ml。
2、制胶首层使用80μl05%正常熔点琼脂糖滴到预热的载玻片上，迅速盖上干净的盖玻片，4℃放置10min使其凝固。
第二层是低熔点琼脂糖与细胞的混合液，取10μl含10000个细胞的PBS和75μl05%低熔点琼脂糖在37℃混匀，然后轻轻揭去盖玻片，将含细胞的低熔点琼脂糖滴到首层胶板上，立即盖上干净的盖玻片，4℃放置10min使其凝固。
第层胶制备同首层胶一致，盖上盖玻片。
3、裂解移去盖玻片，将载玻片浸入新配置的RIPA细胞裂解液中至少裂解25h（尽量使每张玻片裂解时间相同）。此步骤的目的是裂解液由去垢剂及高盐溶液组成，除去溶解细胞膜及核膜，除去蛋白质、RNA等，仅存留核骨架。
4、解旋和电泳细胞裂解后，取出载玻片，用PBS冲洗2次，然后将载玻片置于水平电泳槽中，倒入1XTBE电泳缓冲液，覆胶面025cm，碱解旋20min，4℃冰箱中电泳25~30min，电压25V。
5、染色将载玻片取出，滤纸吸干电泳缓冲液，用Tris-HCl（pH75）中和15min。然后每片载玻片上滴加50μl30μgmL的溴化乙锭（EB）溶液，避光操作，盖上盖玻片，避光染色20min，即可观察。
6、镜检核图像分析EB染色后的样本尽在荧光显微镜下观察并拍照电泳图谱。

注意事项
1、细胞消化不彻底，没有得到单个细胞，多个细胞发生粘连。
2、尾巴形状不完全或者发生扭曲。
3、裂解液处理是本验的关键，裂解液要澄清且完全溶解，裂解不彻底要延长裂解时间或考虑使用强裂解液。
4、溴化乙锭是剧物质，需做好防护，可考虑用其他核酸染料替代。

常见问题
问题1：细胞消化不彻底，没有得到单个细胞，多个细胞发生粘连。
答：细胞消化过程在孵箱中进行消化，可以用移液轻轻吹吸。
问题2：尾巴不完整或者发生扭曲。
答：制胶过程细致小心，不要产生气泡、胶面平整。剥胶过程小心细致。电泳保持在低电压且电压平稳，在4℃冰箱里电泳。


来源：丁香验